Applications of the CRISPR/Cas9 System for Rice Grain Quality Improvement

Leng Chunxu ^1,2,3　Yan Ping ^1,2,3　Wu Licheng ^1,2,3　Wang Yujie ^1,2,3*

1 Biotechnology Research Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Heilongjiang,150028; 2 Northern Japonica Rice Molecular Breeding Joint Research Center, Chinese Academy of Sciences, Heilongjiang, 150028; 3 Key Laboratory of Crop and Livestock Molecular Breeding of Heilongjiang, Heilongjiang, 150086

* Corresponding author, Lkwangyujie@126.com

Abstract　At present, grain quality improvement has become a key target for rice breeding. Rice quality mainly includes appearance, processing, cooking taste and nutritional quality, which is determined by the extremely complicated gene regulation network. As a newly developed targeted gene-editing system, the CRISPR/Cas9 system provides important technical support for rice quality improvement. The system has the advantage of simple operation, high editing efficiency, and easy multi-gene editing. This article combines the research progress of the CRISPR/Cas9 gene-editing system and rice quality-related genes, then introduces in detail the application of the CRISPR/Cas9 system in rice variety improvement. Finally, the problems and improvement strategies of this technology were discussed, the purpose is to provide a reference for creating new high-quality rice varieties using CRISPR/Cas9 technology.

Keywords　CRISPR/Cas9, Gene editing, Quality improvement, Rice

水稻(Oryza sativa)是最重要的粮食作物之一，全世界超过35亿人以大米为食。随着我国生产力水平的大幅提高，外观品质好、蒸煮食味佳的优质稻米越来越受到消费者欢迎。而稻米品质是由极其复杂的调控网络决定的，涉及到水稻种子中相关物质的运输、代谢和生长发育等过程(陈明江, 2018)。近年来，随着现代生物技术的迅猛发展，科学家们通过图位克隆、突变体筛选以及全基因组测序等技术深入研究了一系列调控稻米品质的重要基因，为利用基因编辑对大米品质进行遗传改良奠定了坚实的基础。

基因编辑技术是新近发展的一种遗传操作技术，该技术可在基因组水平对特定DNA序列进行定点删除或插入碱基片段改造目标基因，其在基因功能解析、动植物遗传改良和新品种培育等方面具有重大的应用价值。目前，在作物遗传改良上应用的基因组编辑主要包括TALENs（(transcription activator-like effector nucleases，类转录激活因子效应物核酸酶）)、ZFNs (zinc-finger nucleases,锌指核酸酶)和CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats，成簇规律间隔的短回文重复序列/CRISPR-asssociated nuclease 9，CRISPR相关核酸酶9) 3种类型(图1)，其中ZFNs和TALENs编辑技术因具有效率低，操作复杂、适用作物种类狭窄等缺点难以推广，而CRISPR/Cas9技术因具有编辑效率高、操作简单、脱靶率低、可同时编辑多基因等优势，因此已广泛应用于医学、农学和基础研究等领域(谷峰等, 2015)。

图1 基因编辑系统修复DNA的机制 Figure 1 The gene editing system of DNA repair mechanisms

传统的遗传改良技术主要包括远缘杂交、物理或化学人工诱变、基因打把和RNA干扰等技术，但是这些技术都存在许多缺陷，例如周期长、受生殖隔离限制和不良连锁基因的影响、鉴定困难、效率极低和成本高等。相比上述方法，CRISPR/Cas9技术具有原理简单、精确性高、省时省力、突变目的基因效率高且适用物种范围广等优点，而且更重要的是与转基因技术相比，CRISPR/Cas9技术在靶向修饰特定基因后，经自交或杂交删除外源基因消除了转基因操作带来的安全隐患(单奇伟和高彩霞, 2015)。因此该技术对于水稻品质性状基因的功能鉴定和遗传改良具有巨大的应用潜力。本研究回顾了CRISPR/Cas9基因编辑系统的发展历史、分类及作用原理，概述了稻米品质相关基因的研究进展，介绍了CRISPR/Cas9基因编辑系统在稻米品质改良中的应用，并展望了该技术在水稻品质改良中的发展趋势，为利用CRISPR/Cas9技术创制优质水稻新品种提供参考。

1 CRISPR/Cas9基因编辑系统

1.1 CRISPR/Cas9系统的发展历史

CRISPR/Cas9系统于2013年被评为十大科学进展之一，是近年发展的第三代定向基因编辑技术，具有操作便捷、成本低廉和准确性高等优点。它是来源于细菌和古细菌的天然免疫系统，其功能是识别外来病毒或质粒的核酸序列并进行特异性降解以达到抗病毒的作用。

日本科学家Ishino等于1987首次在大肠杆菌(Escherichia coli)K12发现串联间隔重复序列，该序列位于碱性磷酸酶基因附近，此后在细菌和古细菌中也发现类似重复序列。2002年，Horvach等在嗜热链球菌(Streptococcus Thermophilus)全基因组测序的完成后首次提出CRISPR概念并认为其可能与免疫防御系统有关(Horvath and Barrangou, 2010)。2007年，Barrangou等首次证明CRISPR系统在细菌中行使后天性免疫防御功能，首先细菌被噬菌体侵入后，细菌中Cas基因编码的多个核酸酶和解旋酶对入侵噬菌体的DNA进行切割，然后将这些DNA片段整合到CRISPR的重复序列中。当细菌被噬菌体再次入侵时，转录出RNA，引导Cas蛋白切割外源的噬菌体DNA，从而对噬菌体产生抗性(Barrangou et al., 2007)。2012年，CRISPR的研究取得突破性进展，Jinek等研究表明Type II型CRISPR系统中的Cas9蛋白是一个核酸酶，可结合crRNA (CRISPR RNA)和tracrRNA (trans-activating crRNA)切割双链DNA，进一步研究还发现将crRNA和tracrRNA改造成单链导向RNA，也可以指导Cas9蛋白特异切割双链DNA(Jinek et al., 2012)。2013年，张峰等利用优化的CRISPR/Cas9系统在人类(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)细胞系中进行了基因敲除。利用特异的RNA将Cas9核酸酶带到基因组的靶点上进行切割。CRISPR/Cas9系统继在人类和动物细胞系中实现基因定点修饰后，在植物中开展了广泛的应用。2013年，朱健康团队首次利用CRISPR/Cas9系统对模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻进行了特定基因的定点突变，此后形成了开发利用CRISPR/Cas9系统改良水稻、玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)等粮食作物的研究热潮。

1.2 CRISPR/Cas9基因编辑系统分类

CRISPR/Cas系统由CRISPR序列和Cas蛋白家族组成，根据Cas蛋白核心元件的不同，分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型CRISPR/Cas系统主要来源于细菌和古生菌中，包含Cas1、Cas2、Cas3、Cas5、Cas6和Cas7共6个亚型，靶标为DNA；Ⅱ型CRISPR/Cas系统存在于细菌中靶标也为DNA，含有4个亚型，分别为Cas1、Cas2、Cas4和Cas9；Ⅲ型CRISPR/Cas系统主要存在于古生菌中，包括Cas1、Cas2、Cas6和Cas10共4个亚型，靶标为DNA或RNA。其中，Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系统需多种Cas蛋白共同参与，形成复合物切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas系统只需一种Cas9蛋白就能行使功能，因此Ⅱ型CRISPR/Cas9系统是目前改造最为成功应用最广泛的基因编辑系统。

1.3 CRISPR/Cas9基因编辑系统作用原理

CRISPR/Cas9属于Ⅱ型CRISPR/Cas系统，仅需要成熟的crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白就能实现对外源DNA的切割，Cas9蛋白全长为1 409个氨基酸，含有两个结构域，RuvC-like结构域和HNH核酸酶结构域，HNH结构域位于Cas9蛋白中部，其功能是在PAM（protospacer adjacent motif，原型间隔序列毗邻基序）上游3 nt处切割与crRNA互补配对的模板链，RuvC-like位于Cas9蛋白的N端，其功能是在PAM上游3~8 nt处切割另一条链(Friedland et al., 2013)。

人工改造的CRISPR/Cas9系统由sgRNA（single guide RNA，引导RNA）和Cas9蛋白组成。其中，sgRNA的5’端前20个核苷酸起精确定位作用，引导Cas9蛋白特异性切割与sgRNA互补的基因组DNA双链，产生DSBs (double-strand breaks,双链断裂)，通过HDR (Homology directed repair,同源重组介导的连接)或NHEJ (non-homologous end joining,非同源末端连接)修复途径产生基因突变(Jinek et al., 2014) (图1)。

2稻米品质相关基因研究进展

稻米品质是由多基因控制的数量性状，主要包括外观品质、加工品质、蒸煮食味品质以及营养品质，其中加工品质主要包括糙米率、精米率和整精米率等指标；外观品质是由粒型、垩白、籽粒色泽和透明度等指标决定；蒸煮食味品质与糊化温度、直链淀粉含量和胶稠度直接相关，也受香味的类型及浓淡的影响；营养品质与稻米中蛋白质、脂肪、维生素和矿质元素含量有关，目前主要以蛋白质含量为指标。

2.1外观品质相关基因研究

稻米外观品质主要由粒型和垩白等因素决定，粒型不但决定外观品质而且与产量息息相关，粒型相关基因的克隆与功能分析一直是稻米品质研究的热点。目前已获得几十个粒型相关基因或等位基因，其中与粒长相关的基因有GS3、GL3.1/OsPPKL1和GW7/GL7等，与粒宽相关的基因有GW2、GW5/qSW5和GS5等，与粒型相关的基因有GS6、TGW6、GW8/OsSPL16和OsGRF4/GS2/GL2等。GS3是一个控制粒长的主效QTL，位于N端的植物特异的OSR结构域是控制粒长的负调节因子，OSR功能缺失后籽粒变长(Mao et al., 2010)。GW2是第一个被发现的粒宽基因，编码一个E3泛素连接酶，突变后细胞数目增加，籽粒变宽(Song et al., 2007)。GS6属于GRAS基因家族，对水稻籽粒大小具有负调控作用(Sun et al., 2013)。

垩白也是影响衡量稻米外观品质标准之一，形成原因是在水稻灌浆时，胚乳中的淀粉粒和蛋白质积累不够紧密形成的白色不透明物质。出现垩白的稻米透明度差、硬度低，脱粒时易碎，导致整精米率下降，蒸煮后米粒容易断裂而影响食味品质。垩白是由多基因控制的复杂性状，同时也受环境影响，环境温度越高垩白越多。目前已分离到一些垩白相关QTL与基因，但其具体调控机制还没有研究清楚。例如，Kang等(2005)利用水稻粉状胚乳突变体获得了一个编码丙酮酸磷酸激酶的OsPPDKB基因，该基因通过调节碳代谢而影响胚乳灌浆。Wang等(2008)克隆了一个编码细胞壁转化酶基因G1F1，该基因的功能是调控籽粒灌浆期的碳源分流，当其功能缺失时会造成高垩白。与垩白形成相关的基因还有PDIL1-1基因和编码液泡H⁺-焦磷酸酶转移酶基因chalk5。

2.2加工品质相关基因研究

稻米加工品质由糙米率、精米率和整精米率等指标决定，是一个及其复杂的性状，其遗传机理还不清楚。在过去的几十年间，随着高通量测序技术的发展，已经鉴定出一批与加工品质相关的QTL。梅捍卫等根据Lemont/特青RI群体212个株系的糙米率、精米率和整精米率等品质性状定位了5个QTL，其中1个控制精米率，4个为整精米率主效QTL (梅捍卫等, 2002)。翁建峰等利用Asominori为遗传背景的置换系群体，对稻米糙米率、精米率和整精米率进行QTL定位，共检测到30个QTL与加工米质有关(翁建峰等, 2007)。穆平等采用混合线性模型QTL定位法检测到11个QTL，在第1染色体RM295附近共检测到5个QTL，分别控制粒长、长宽比、精米率和整精米率(穆平等, 2007)。研究表明，粒长与整精米率呈负相关，例如qBRR3和qBRR5是2个控制糙米率的主效QTL，分别定位在3号和5号染色体上，同时也参与调控粒宽和粒长；qHRR3是1个定位在3号染色体的主效QTL，参与调控整精米率和粒长(Tan et al., 2001)。

2.3蒸煮食味品质相关基因研究

稻米的蒸煮食味品质是指稻米煮成米饭后，对米饭的色泽、气味、形态和适口性等感官指标的综合评价，主要由淀粉的理化性质决定的。蒸煮食味品质的形成是由淀粉合成相关基因的调控网络决定。Tian等(2009)分析了37个粳稻品种和33个籼稻品种的直链淀粉含量、糊化温度和胶稠度，发现直链淀粉含量与糊化温度和胶稠度呈负相关，而糊化温度与胶稠度呈正相关。同时选择18个淀粉合成相关基因进行测序，结果表明Wx基因是控制直链淀粉合成的主效基因。Wx基因编码的蛋白为GBSSI (granule bound starch synthase I, 颗粒淀粉合成酶)，位于第6号染色体上，由13个外显子和14个内含子组成。水稻中目前已经报道了多个Wx的等位基因和功能位点，如Wx^a、Wx^b、Wx^hp、Wx^op、Wx^mp、Wxⁱⁿ和Wx^lv等，不同的等位基因对直链淀粉含量有不同的效应。研究表明Wx基因同时直接影响胶稠度的大小，Li等研究认为位于第2、第7染色体上的QTL共同控制胶稠度。糊化温度的主要调控基因为SSII-3，由高振宇等采用图位克隆法分离获得，序列分析表明其编码可溶性淀粉合酶II (solube starch synthase II, SSII)，该基因的不同等位变异引起了支链淀粉晶体层结构的改变，从而导致糊化温度的变化。

此外，随着市场的需要，香味已成为重要食味品质之一。Bradbury等(2005)克隆了香味基因Badh2，该基因位于第8染色体，包含15个外显子和14个内含子，编码的蛋白为甜菜碱醛脱氢酶，该酶的功能是催化甜菜碱醛、3-氨基丙醛和4-氨基丁醛发生氧化。OsBADH2蛋白失活，不能氧化4-氨基丁醛，造成其大量积累产生香味。

2.4营养品质相关基因的研究

大米含有的营养物质主要包括蛋白质、微量元素和其他营养物质。关于水稻蛋白质基因和QTL的研究很多，Kawakastu等(2009)发现OsRISBZ1和OsRPBF是水稻种子储藏蛋白的转录激活因子，OsRISBZ1和OsRPBF基因突变后储藏蛋白含量显著下降。Wang等从水稻胚乳粉状突变体gpa1中克隆了OsRab5a基因，该基因在水稻贮藏蛋白转运过程中起重要作用，其功能缺失后导致谷蛋白无法运输到蛋白体II中(Wang et al., 2010)。Peng等克隆了1个主效QTL，qPC1通过调控谷氨酸、丙氨酸、球蛋白、白蛋白和淀粉的合成和积累来控制谷蛋白含量。qPC1编码氨基酸转体OsAAP6，正向调控蛋白质含量(Peng et al., 2014)。Wang等(2016)研究表明GPA4编码一个进化保守的膜蛋白GOI1B，该蛋白通过调控COPII囊泡形成促进细胞中分泌蛋白的运输。

3 CRISPR/Cas9系统在稻米品质改良中的应用

稻米品质负调控基因的不断挖掘，为利用CRISPR/Cas9技术对水稻品质遗传改良和新品种培育提供了坚实的基础。传统育种是通过杂交和回交等方法将优良性状导入受体品种中，这种育种方式需要对大规模的后代群体进行筛选，既耗时又费力，而CRISPR/Cas9技术通过反向遗传的方式直接定向改造目的基因，从而将加速优质、高产、高抗和高效水稻新品种的培育和推广。目前，CRISPR/Cas9技术主要集中应用于水稻外观和加工品质、蒸煮和食味品质以及营养品质的遗传改良(表1)。

表 1 CRISPR/Cas9系统在水稻品质遗传改良中的应用 Table 1 Application of CRISPR/Cas9 system in genetic improvement of rice quality

3.1稻米外观和加工品质的改良

许多稻米外观品质相关的基因已被发现，并可用于CRISPR/Cas9技术的开发利用。沈兰等利用CRISPR/Cas9系统，以控制粒型基因GS3和控制每穗粒数基因Gn1a为对象构建基因编辑载体，用农杆菌介导法转化吉粳22、垦鉴稻6号、空育131和长白25，分别获得了无选择标记的gs3和gs3gn1a移码突变体，对T₁代表型分析发现突变体gs3和gs3gn1a粒长变长，千粒重增加；与突变体gs3相比，突变体gs3gn1a每穗粒数显著增加(沈兰等, 2017)。水稻TGW6 (Thousand Grain Weight 6)基因编码吲哚乙酸-葡萄糖水解酶，该基因突变后吲哚乙酸含量减少，而籽粒长和重反而增加。王加峰等利用CRISRP/Cas9技术对TGW6基因定点编辑，获得了一套有重要育种价值的tgw6突变体(王加峰等, 2016)。Xu等应用CRISPR/Cas9多基因编辑系统对3个粒重负调控基因GW2、GW5和TGW6进行突变，结果表明基因编辑后代的粒长和千粒重显著增加(Xu et al., 2016)。

3.2稻米蒸煮食味品质的改良

稻米的食味品质主要由直链淀粉含量决定，而Wx基因是控制直链淀粉含量的主效基因。研究表明，通过对Wx基因编辑可获得稳定遗传、直链淀粉含量适宜的突变体。例如，汪秉琨等利用CRISPR/Cas9系统对 “楚粳27”的Wx基因进行定点编辑，获得9个独立的转化株系，测序发现转化株系出现缺失和单碱基插入两种突变类型，与野生型相比，突变体中直链淀粉含量显著降低。

与淀粉合成相关的其它基因，也陆续用于基因编辑的研究。异淀粉酶OsISA1基因编码一类在支链淀粉合成中起重要作用的异淀粉去分支酶。Chao等利用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制isa1突变体，这些突变体胚乳萎缩，直链淀粉含量显著降低，总可溶性糖含量增加，淀粉粒形态发生改变。OsPUL基因属于淀粉脱支酶家族，在胚乳中特异性表达，在种子萌发的淀粉降解过程起着重要的作用。奉宝兵等对稻米脱支酶OsPUL基因进行定点编辑，其突变体后代不但直链淀粉含量降低18.7%，而且其蛋白质含量也增加22.02%，这说明OsPUL不仅调控淀粉合成，还影响储藏蛋白的含量(奉宝兵等, 2019)。OsSBE3是位于第2号染色体上的水稻淀粉分支酶基因，该基因表达量的降低可引起水稻抗性淀粉含量的提高，而抗性淀粉有降低餐后血糖和胰岛素应答等生理功能。白建江等利用CRISPR/Cas9技术对SBE3基因的第8外显子进行突变，结果纯合突变体中的抗性淀粉含量达到10%以上(白建江等, 2018)。Sun等对淀粉分支酶SBEⅠ和SBEⅡb基因定点突变，sbeⅡ突变体中直链淀粉含量和抗性淀粉含量分别增加25.0%和9.8%(Sun et al., 2017)。

香味是稻米的重要食味品质之一，稻米在蒸煮和食用过程因散发清香气味而深受消费者喜爱，而水稻香味遗传受第8号染色体上单个隐性基因Badh2控制，因此国内外学者利用CRISPR/Cas9载体编辑Badh2基因构建香型水稻突变体的研究也越来越多。王付华等（2018）利用CRISPR/Cas9系统突变香味基因Badh2，分别创制香型“秀水134”和香型“郑稻19”，杨平等(2019)利用CRISPR/Cas9系统成功编辑水稻Wx、Badh2基因，获得了稳定遗传、较低直链淀粉含量且带有香味的突变体。

3.3稻米营养品质的改良

贮藏蛋白约占稻米干重的8%~16%，是仅次于淀粉的第二大成分，与稻米营养品质密切相关。稻米中的蛋白分为谷蛋白、盐溶蛋白和醇溶蛋白三类，其中谷蛋白含量最高，占全蛋白的80%，富含赖氨酸和精氨酸等易于消化吸收，是优良的植物蛋白，然而对于肾病和糖尿病患者来说，大量吸收谷蛋白会导致病情恶化。水稻谷蛋白基因分为GluA和GluB两个亚家族，GluA3属于GluA亚家族(Takaiwa and Oono, 1991)。周优等(2019)在GluA3基因的第4外显子处设计特异的靶序列用于CRISPR/Cas载体的构建，农杆菌转化粳稻品种“嘉华1号”，成功获得2种低谷蛋白突变体材料。

稻米中也含有一些人体代谢不可或缺的微量元素，如维生素A、类黄酮、花青素等。类胡萝卜素是维生素A的前体，维生素A缺乏可导致永久性失明。稻米的胚乳中不积累类胡萝卜素，原因是类胡萝卜素代谢能力下降，生物合成活性较低造成的。Yang等(2017)利用CRISPR/Cas9系统对5个水稻类胡萝卜素分解代谢基因OsCYP97A4、OsDSM2、OsCCD4a、OsCCD4b和OsCCD进行靶向突变，以促进水稻种子类胡萝卜素的积累，但5个基因的单等位和双等位基因敲除均未积累类胡萝卜素。

镉(Cd)是一种毒性极高的重金属，土壤中的镉通过根经木质部运输到叶和茎中，生殖生长时大部分的Cd通过木质部和韧皮部优先运输到籽粒中。因此了解水稻内Cd吸收和转运的生理过程和分子机制对低Cd水稻育种至关重要。OsNramp5基因实参与水稻中镉、锰和铁运输的转运蛋白，其功能缺失可大幅降低稻米中镉的含量(Ishimaru et al., 2012)。Tang等(2017)利用CRISPR/Cas9技术敲除OsNramp5基因，获得低镉含量的具有“Huazhan”和“Longke638s”背景的osnarmp5突变体，这两个突变体广泛应用于两系杂交籼稻育种。

4问题与展望

稻米品质是一个综合性状，体现在品质性状与环境之间、品质性状之间以及品质与产量性状之间的相互影响，因此在传统的稻米品质改良中会有几个性状相互制约的现象。例如，米粒细长可以提高外观品质，但会降低整精米率和产量；米粒变宽能增加粒重和产量，但会增加垩白。而CRISPR/Cas9系统能够特异性地、有针对性地编辑水稻品质基因，具有操作简单、精度高、周期短和成本低等优点，可根据稻米品质的不同需求，协调好外观品质、加工品质和产量之间的关系，选育出满足市场需求商业化的优质水稻新品种。

CRISPR/Cas系统是近年来生命科学研究领域的重大发现之一，能够特异地对品质性状进行定向改良而不改变其它性状从而保证了水稻基因组的稳定性，具有广阔的应用前景和发展潜力。不但克服了传统育种技术的缺点，节约时间成本、提高效率、丰富育种材料，还能避免转基因技术的安全问题，基因编辑后没有外源基因的污染，选育品种的安全性更高。然而，CRISPR/Cas9系统也存在一些问题，如脱靶效应高和同源重组编辑效率低等问题。2015年张峰等在CRISPR/Cas9系统基础上发现新的基因编辑系统CRISPR/Cpf1 (图1)，与CRISPR/Cas9相比具有靶基因序列更简单、更高效而且脱靶效应几乎没有。CRISPR/Cpf1系统还处于初步探索阶段，在水稻中的实际应用比较少，Hu等和Wang等在2017年成功实现了Cpf1对水稻基因组的编辑，未来具有很大的开发潜力。

总之，随着水稻基因组研究水平的提高，水稻品质性状的规模化基因发掘得以快速发展，通过CRISPR/Cas9系统将单一或多个优良米质相关基因聚合到同一品种将成为未来培育优质水稻品种的发展方向，必将为我国水稻新品种培育带来质的飞跃。

作者贡献

冷春旭负责综述的资料收集、分析及初稿的撰写；闫平完成论文的修改；吴立成参与文献资料的分析和整理；王玉杰是综述的负责人，指导综述的写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家重点研发计划(2017YFD0100504)、国家现代农业产业技术体系(CARS-01-54)、农业科研杰出人才培养计划(2016-2020-48)、国家粮食丰产工程项目(2017YDF-0300506-6)和黑龙江省农业科学院院级科研项目(2019YYYF011)共同资助。

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